Репрезентативные белки и их преобладающие паттерны гликозилирования, связанные с определенными субклеточными компартментами, а также плюсы и минусы. Кредит: BioDesign Research (2024). DOI: 10.34133/bdr.0047
Молекулярное фермерство растений (PMF) — это современная, сложная технология, которая использует биосинтетические машины растений для синтеза множества рекомбинантных белков, включая промышленные и терапевтические ферменты. Она имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными подходами, такими как микробная ферментация и культивирование клеток млекопитающих, включая более низкие затраты, высокую урожайность и отсутствие человеческих патогенов и эндотоксинов. Растения также обеспечивают значительную гибкость, что позволяет производить белки по индивидуальному заказу.
Такие виды табака, как Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum, известны тем, что у них нарушен базальный иммунитет и менее надежный путь подавления рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий деградацию чужеродной РНК в качестве защитного механизма. Это, наряду с его коротким жизненным циклом и большой способностью к производству биомассы, делает его идеальным выбором для быстрого и эффективного производства рекомбинантного белка.
Однако, несмотря на эти многочисленные преимущества, существуют определенные ограничения для производства этого белка. Клетки табака требуют инженерии для специфической субклеточной локализации каждого рекомбинантного белка.
В то время как многочисленные исследования изучали производство рекомбинантного белка в табаке, требовалось всестороннее исследование стратегий субклеточной локализации. Обзор, опубликованный в BioDesign ResearchРассматривает эту проблему и фокусируется на стратегиях таргетинга для направления рекомбинантных белков в четыре субклеточных компартмента — эндоплазматический ретикулум (ЭР), вакуоль, хлоропласт и апопласт.
Предоставляя более подробный контекст, доктор Ши-Цзянь Сун, исследователь из Китайской академии сельскохозяйственных наук, Китай и один из авторов-корреспондентов этого исследования, говорит: «Оптимизация субклеточной локализации для отдельных целевых белков имеет решающее значение для успешного синтеза белка и его использования в фармакологической промышленности».
ER признан для локализации рекомбинантного белка, поскольку он содержит молекулярные шапероны, которые способствуют сворачиванию белка, а также минимизируют риски деградации белка. Белки, направленные в ER, подвергаются гомогенному гликозилированию, реакции, включающей добавление углеводов, что необходимо для многих терапевтических белков. Накопление рекомбинантных белков в растительном ER может быть достигнуто путем включения N-концевого специфического ER-таргетинга или сигнального пептида секреции вместе с C-концевой удерживающей последовательностью.
Подчеркивая ограничения исследования, д-р Инхван Хванг, другой автор-корреспондент этого исследования, упоминает: «Перегрузка ER может вызвать стресс ER, что приведет к значительному снижению выхода белка в таких случаях». Этого можно избежать, если осуществлять осторожное управление во время уровней экспрессии.
Результаты этого исследования показывают, что локализация ER оптимальна для крупных сложных гликопротеинов (белков с прикрепленными углеводами), которым для сворачивания нужны шапероны. Эти гликопротеины имеют структуру углеводов, прикрепленных к атому азота, похожую на белки млекопитающих.
Растительная вакуоль является еще одной важной органеллой в табаке, занимая около 80%-90% объема клетки в листьях табака. Технология PMF использует эту огромную емкость для хранения рекомбинантных белков. Сигналы сортировки вакуолей, которые могут быть как локальными, так и последовательными, имеют решающее значение для нацеливания вакуолей.
Указывая на интересный аспект этих вакуолей, доктор Хай-Пин Дяо говорит: «Белки могут попадать в вакуоль разными путями. Рекомбинация осуществляется для того, чтобы гарантировать, что белок напрямую транспортируется из ЭР в вакуоль, минуя аппарат Гольджи».
Некоторые белки также имеют тенденцию к деградации в вакуоли из-за присутствия расщепляющего фермента, называемого протеазой. Поэтому лучше всего локализовать белки, которые устойчивы к кислой среде или естественным образом локализуются в лизосоме человека.
Хлоропласты в тканях листьев табака хранят самый высокий уровень нативных белков, что делает их идеальными для накопления больших количеств рекомбинантного белка. Существуют две основные стратегии накопления больших количеств рекомбинантных белков — трансформация хлоропластов и ядерная трансформация.
Трансформация хлоропластов обеспечивает стабильную экспрессию чужеродных генов, оптимальные условия сворачивания белков и минимальный риск переноса в окружающую среду. Однако создание высокоурожайных трансгенных растений с помощью этого процесса является сложным и трудоемким из-за определенных технических проблем.
С другой стороны, ядерная трансформация включает рекомбинантный белок, слитый с транзитным пептидом хлоропласта, что позволяет быстрее производить белок. Исследование показывает, что локализация хлоропластов может работать лучше всего для белков, которые не требуют обширных биохимических модификаций.
Апопласт растений, важнейшее пространство между клеточной мембраной и клеточной стенкой в растительных клетках, считается прекрасным местом для накопления рекомбинантного белка. Накопление белка в апопласте также упрощает метод очистки.
В то время как более мелкие рекомбинантные белки могут быть напрямую извлечены из жидкости апопласта, крупные белковые комплексы требуют обычного процесса очистки. Рекомбинантные белки также могут иметь нарушенную структурную целостность из-за присутствия протеазы в апопласте. Чтобы избежать этого осложнения, коэкспрессия ингибитора протеазы все чаще используется в качестве новой стратегии.
PMF имеет потенциал для революции в производстве рекомбинантных белков. Однако остаются адаптивные уровни производства, сопоставимые качества и проблемы стоимости. Развиваясь дальше, доктор Ши-Цзянь Сун говорит: «Чтобы нормализовать использование трансгенных растений в промышленных исследованиях, важно строго придерживаться протоколов, улучшать участие общественности и следовать надежным протоколам безопасности».
Реконструкция шасси табачного растения, включая низкоэффективную обработку протеазы, эффективное распределение ресурсов и создание реактора для растений, свободного от токсинов, может помочь в дальнейшем продвижении. Окончательная коммерциализация биопроизводства является важнейшим признаком развития PMF.
Дополнительная информация: Ши-Цзянь Сун и др., Достижения в области разработки субклеточного накопления для производства рекомбинантного белка в табаке, Исследования биодизайна (2024). DOI: 10.34133/bdr.0047
Предоставлено Нанкинским сельскохозяйственным университетом
