Новые знания о флуоресцентных «темных состояниях» проливают свет на пути к улучшению визуализации

Важные новости

«Новые

Визуализация smFRET с высоким временным разрешением. Авторы и права: Nature Methods (2024 г.). DOI: 10.1038/s41592-024-02293-8

Ученые из детской исследовательской больницы Св. Джуда сообщили о способе улучшения измерений расстояний на молекулярном уровне с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции одной молекулы (smFRET). smFRET количественно определяет свойства возбуждения и излучения химических веществ, называемых флуорофорами. Результаты были опубликованы в журнале Nature Methods.

Когда возбужденный электрон во флуорофоре расслабляется, он после задержки излучает свет, заставляя молекулу светиться (флуоресцировать). Однако флуорофоры не всегда флуоресцируют после возбуждения. Вместо этого посредством квантово-механических процессов, связанных со «спиновым» состоянием возбужденного электрона, они могут переходить в долгоживущие триплетные темные состояния, которые не флуоресцируют.

Это снижает чувствительность и точность измерений smFRET. Контролируя продолжительность темных состояний с помощью технологий «самовосстановления», ученые из Сент-Джуда теперь показывают, что триплетные темные состояния можно значительно смягчить.

Это достижение значительно повышает разрешающую способность метода для продвижения в области молекулярных исследований. визуализация.

smFRET фиксирует мимолетные молекулярные моменты

Для съемки взмахов крыльев колибри требуются специальные камеры с высокой частотой кадров и освещением, позволяющим избежать размытия при быстром движении. Визуализация полета колибри меркнет по сравнению с задачами по выяснению функций биомолекул в нашем организме.

Биомолекулы меньше длины волны света (порядка одной миллиардной дюйма), и их функции связаны с их движением, меняющим положение или форму (конформацию) от сотен до тысяч раз в секунду.

Измерение этой мимолетной динамики жизненно важно для истинного понимания того, как молекулы выполняют свои функции, как эти функции нарушаются при заболевании и как лекарственная терапия изменяет их активность. smFRET, метод молекулярной визуализации, представляет собой мощный способ непосредственной визуализации того, как биомолекулы движутся в режиме реального времени и в масштабе одной молекулы.

В Сент-Джуде Скотт Бланшар, доктор философии, кафедры кафедры структурной биологии и химической биологии и терапии, продвигает область визуализации smFRET. Усилия лаборатории Бланшарда в рамках Центра визуализации одиночных молекул Сент-Джуда сыграли решающую роль в проектировании и разработке флуорофоров, которые позволяют проводить измерения на молекулярном уровне.

«Наиболее распространенные и широко используемые флуоресцентные молекулы, как правило, не справляются с задачей количественной оценки событий на молекулярном уровне. Это побудило нас взяться за задачу синтеза наших собственных флуорофоров», — сказал Бланшар. «В процессе мы поняли, что фундаментальную фотофизику флуоресценции необходимо изменить».

Чтобы провести эксперименты smFRET, исследователи помещают флуорофоры в две точки биомолекулы. Когда лазер направляется на первый из этих флуорофоров (донор), электрон внутри него получает эту энергию и становится возбужденным.

При релаксации электрона эта энергия передается через пространство второму флуорофору (акцептору), но только в том случае, если он находится близко к донору. Записывая и количественно оценивая вспышки флуоресценции как от донорских, так и от акцепторных флуорофоров, можно измерить расстояния порядка одной миллиардной дюйма.

Каждая часть информации жизненно важна для понимания биологических функций и неисправностей. Однако правильное использование метода требует тщательного изучения фундаментальных свойств флуоресценции.

Электронный спин-флип блокируется в триплетном состоянии

Правила, регулирующие излучение света флуорофором, вращаются вокруг спина электрона. Когда возбужденный электрон расслабляется, он должен вернуться в исходное состояние, сохраняя свое спиновое состояние или спиновое квантовое число. Однако это происходит не всегда.

Новое понимание флуоресцентных

Изображение smFRET с высоким пространственным разрешением. Авторы и права: Nature Methods (2024 г.). DOI: 10.1038/s41592-024-02293-8

«Каждый раз, когда электрон возбуждается, существует вероятность того, что он потеряет память о своем вращении и примет инвертированное спиновое состояние», — сказал Бланшар, автор исследования Природные методы исследование.

«Хотя этот процесс относительно редок, с вероятностью примерно 1 из 100, если он действительно меняет свое спиновое состояние, то он попадает в это в 100 000 раз более продолжительное триплетное состояние, которое не флуоресцирует. Следовательно, флуорофор становится намного тусклее, чем в противном случае могло бы быть и другое.

«В области флуоресценции боролись с этой проблемой в течение многих лет», — добавил Бланшар. «В контексте FRET мы заметили, что скопления триплетных состояний изменяются в зависимости от интенсивности освещения и варьируются. для разных флуорофоров.»

FRET требует, чтобы донорные и акцепторные флуорофоры вели себя одинаково. Но поскольку метод требует непосредственного возбуждения одного, а не другого, при включении лазера триплетные состояния донора и акцептора заполняются с разной скоростью.

«В конечном итоге вы получаете неприятный процесс, когда донор и акцептор находятся на разных уровнях, поэтому они теряют производительность в разной степени», — объяснил Бланшар. «Экспериментальные показания становятся разнообразными, что приводит к снижению качества и надежности данных визуализации. Это фундаментально ограничивает пределы как пространственного, так и временного разрешения измерений smFRET».

Основной целью инженерных исследований флуорофоров является: следовательно, сократить время жизни триплетных состояний настолько, насколько это возможно. Это основная цель технологий «самовосстановления».

«Чтобы обеспечить точные измерения расстояний в данных smFRET, в настоящее время эта область опирается на этапы калибровки, которые явно не учитывают триплетные состояния», — объяснил один из первых автор Зелиха Килич, доктор философии, кафедра структурной биологии Сент-Джуда.

«Технологии самовосстановления приближают поле к оптимальным условиям, когда триплетные состояния отсутствуют, гарантируя, что используемые этапы калибровки дадут более точные результаты и, следовательно, измерения расстояний».

Самовосстанавливающиеся флуорофоры указывают путь

Самовосстанавливающиеся флуорофоры указывают путь

Самовосстанавливающиеся флуорофоры

h2>

Химические вещества, называемые тушителями триплетного состояния, такие как циклооктатетраен, противодействуют этому явлению, но также имеют тенденцию запутывать работу. «Циклооктатетраен жирен, обладает разнообразной и низкой растворимостью, и его сложно контролировать», — сказал Бланшар.

В предыдущих публикациях команды Бланшара сообщалось о разработке флуорофоров с непосредственно присоединенным циклооктатетраеном. Этот подход решил проблему растворимости и создал «самовосстанавливающиеся» флуорофоры, в которых заселенность триплетных состояний была уменьшена почти в 1000 раз.

В новом исследовании исследователи продемонстрировали, что использование самовосстанавливающихся флуорофоров в качестве доноров и акцепторов в экспериментах smFRET улучшает качество и надежность данных и предотвращает потерю качества изображения при увеличении интенсивности лазера. Эти улучшения расширяют границы smFRET, а технологии самовосстанавливающихся флуорофоров находят все более разнообразные применения во всем мире.

«Повышенная яркость и фотостабильность самовосстанавливающихся флуорофоров позволяют улучшить пространственно-временное разрешение smFRET. визуализация впечатляет», — сказал соавтор исследования Авик Пати, доктор философии, ранее работавший на факультете структурной биологии Сент-Джуда, а теперь в Институте технологий и науки Бирлы.

«Теперь мы можем точно оценить конформационную динамику в нанометровом масштабе внутри отдельных биомолекул за доли миллисекунды и при физиологических концентрациях кислорода».

Бланшар уверен, что эти результаты помогут исследователям из Сент-Джуда и более широкому научному сообществу. «Расширение границ инноваций в области визуализации в Сент-Джуде является частью стратегического плана учреждения, и мы уверены, что самовосстанавливающиеся флуорофоры сыграют важную роль в достижении наших целей», — сказал он.

» Более того, многие, вероятно, выиграют от этих достижений, поскольку подход самовосстановления показал потенциал для улучшения большинства приложений флуоресценции».

Дополнительная информация: Avik К. Пати и др. «Восстановление истинной эффективности FRET на основе исследований smFRET требует смягчения последствий триплетных состояний», Nature Methods (2024). DOI: 10.1038/s41592-024-02293-8

Информация журнала: Nature Methods

Предоставлено Детской исследовательской больницей Св. Иуды

Новости сегодня

Последние новости